Organización de los genes, transcripción y traducción en células eucariontes.

En los eucariontes, en general, la disposición de los genes que codifican las enzimas que participan en una misma vía metabólica (en este ejemplo, la síntesis de trp) están separadas en el genoma, incluso pueden estar en cromosomas diferentes. Con lo cual, en este caso tenemos cinco sitios de inicio para la transcripción, cada uno de esos sitios correspondientes a cada uno de esos cinco genes. Entonces, cuando se transcriben en ARN, se obtienen cinco transcriptos primarios de ARNm que luego se procesan y posteriormente son traducidos para dar las 5 proteínas que intervienen en esa vía metabólica.

En las células eucariontes hay compartimientos, entre los cuales se encuentran el núcleo y el citoplasma. El proceso de transcripción ocurre en el núcleo, lo mismo pasa con el proceso de modificación de este transcripto primario.

Recién una vez que el transcripto primario es correctamente codificado puede salir del núcleo al citoplasma donde se lleva a cabo la traducción, con lo cual, en este caso, la transcripción y la traducción ocurren de manera separada en espacio y tiempo: esta es una diferencia importante con lo procariontes.

Organización de los genes, transcripción y traducción en células procariontes.

En general, en los procariontes, las enzimas o las proteínas que están dedicadas a una vía metabólica común se agrupan en una estructura o sistema que se denomina operón, en este caso se esquematiza el operón trp.

Este operón codifica para cinco enzimas mencionadas como A, B, C, D y E e intervienen en la síntesis de este aminoácido en la bacteria; entonces en el ADN bacteriano, en el único cromosoma bacteriano, estas secuencias que codifican para estas cinco enzimas se encuentran contiguas, de modo tal que existe un único sitio de inicio de la transcripción de este gen. Esta es una diferencia importante con los eucariontes: en los procariontes hay un único sitio de inicio para la transcripción del ARNm.

Entonces se produce la transcripción y se obtiene un único producto. Un único ARNm que sí tiene 5 sitios diferentes para la traducción, para la síntesis de las proteínas correspondientes. Cuando este único ARNm se traduce se obtienen 5 proteínas diferentes que son las enzimas que intervienen en esta vía metabólica.
En los procariontes la transcripción y la traducción ocurren de manera simultánea, no hay compartimentalización entre núcleo y citoplasma, por lo cual, a medida que el ARNm emerge de la ARNpol, éste puede ser traducido.

Etapas de la transcripción del ADN.

Básicamente la transcripción es un proceso que está dividido en tres etapas.

Iniciación.

La iniciación es la primera etapa de la transcripción.

En la figura se muestra una molécula de ADN de doble cadena; con un círculo verde se indica la secuencia que marca el sitio de inicio para la transcripción de ese ADN sobre la hebra molde. De estas dos hebras, una de ellas va a actuar como molde. Lo que se representa en forma grande es la ARNpol y toda la secuencia que está marcada es lo que se conoce como promotor o secuencia promotora que es el sitio donde se une la ARNpol para comenzar la transcripción (síntesis de ARN). Por otro lado se ve, representado con un círculo rojo, secuencias de sitio de detención sobre la hebra molde. Ahí, en ese punto, finaliza la transcripción.
En este estadío donde recién se une la ARNpol al sitio promotor para comenzar la transcripción, que además requiere de proteínas especiales que se denominan factores de transcripción generales, todo este complejo se denomina complejo cerrado porque todavía el ADN se encuentra “cerrado”.
Una vez que la ARNpol se posiciona correctamente y reconoce el sitio de inicio, se forma lo que se conoce como burbuja de transcripción. Hay enzimas que colaboran para la apertura de esta doble hélice y se forma la burbuja de transcripción que consta aproximadamente de 10 a 14 nucleótidos. Una vez formada esta burbuja de transcripción, la ARNpol comienza la adición de los rNTP iniciales. Se dice que la etapa de iniciación finaliza cuando los dos primeros rNTP se han polimerizado sobre la hebra molde.

Elongación.

La segunda etapa es la elongación.

La ARNpol va a avanzando sobre la hebra molde de ADN hacia el extremo 5' de la misma, adicionando en cada paso rNTP que se aparean de manera complementaria a la hebra molde de manera transitoria y los rNTP se unen entre sí por uniones fosfodiéster. Entonces, en este punto hay una burbuja de transcripción que se va corriendo hacia el extremo 5' de la hebra molde y una región híbrida donde observamos una hélice doble de ADN-ARN. Por otro lado, en uno de los extremos de la ARNpol comienza a surgir la molécula de ARN naciente, que comienza a separarse de la hebra molde de ADN y a emerger de la ARNpol.

Terminación.

 La tercera y última etapa de la transcripción es la de terminación.

Cuando la ARNpol llega a este sitio específico (secuencia específica), que se denomina sitio de terminación, finaliza la transcripción: se libera la ARNpol, el ARN completo y todo esto se disocia completamente de la molécula de ADN.
En el caso de células eucariontes, esta hebra de ARN que completa su síntesis y emerge de la ARNpol es lo que se conoce como transcripto primario o pre ARNm. Esta molécula debe sufrir modificaciones para transformarse en un ARNm maduro.

Un video para ilustrar la transcripción:

Estructura de la ARNpol.

Esta imagen es simplemente para observar la interacción entre las moléculas. Este modelo representa la estructura de una ARNpol bacteriana unida a un promotor. Se puede observar cómo interactúan íntimamente estas dos moléculas. Se ve la interacción complementaria entre el ADN y la ARNpol. Existe un sitio químico dentro de esta ARNpol donde encaja perfectamente la doble hélice del ADN. Este complejo se mantiene estable por interacciones no covalentes.

La ARNpol está formada por varias subunidades, las más importantes son las subunidades β (tiene dos subunidades β), tiene dos subunidades α pero en este esquema se ilustra una sola y puede tener subunidades adicionales, en este caso posee una subunidad ω, que estabiliza la enzima y asiste en el ensamblaje de sus subunidades.

Las ARNpol eucariontes son muy similares a las procariontes.

Transcripción de genes codificadores de proteínas.

La transcripción de genes codificadores de proteínas es lo que se denomina también como síntesis de ARN.
Todos los tipos de ADN están codificados en el ADN y se forman mediante este mecanismo.

Para el proceso de transcripción se necesita una hebra molde de ADN que permita copiar esta información. En este caso, los monómeros son nucleótidos. El crecimiento del ARN, en direccionalidad, es igual que para el ADN, se sintetiza de 5'→3', y mientras se sintetiza se van apareando de manera complementaria la base correspondiente a la molécula de ARN con la base de la hebra molde, con lo cual estas estructuras van a ser antiparalelas transitoriamente.
Esta reacción de polimerización para formar la molécula de ARN es llevada a cabo por una enzima que es la ARN polimerasa (ARNpol). La ARNpol cataliza una reación química que consiste en el ataque nucleofílico del -OH 3' de la ribosa hacia el fosfato α del nucleótido entrante. El nucleótido tiene 3 grupos fosfatos y el fosfato más próximo al azúcar es el fosfato α, luego sigue el fosfato β y por último el γ. Es decir, la enzima corta a nivel del fosfato α, liberando pirofosfato, y este nucleótido entrante queda unido covalentemente a este -OH (3') por una unión fosfodiéster; a su vez esta base nitrogenada de este nucleótido entrante queda apareado complementariamente de manera transitoria al ADN molde.

→ La reacción de polimerización es catalizada por la ARNpol. Químicamente consiste en el ataque nucleofílico del -OH 3' de la ribosa sobre el grupo fosfato en posición α del nucleótido entrante (rNTP) (el nucleótido que se va a adicionar), que por un lado está apareado complementariamente con la base de la hebra molde de ADN. Si, por ejemplo, en la hebra molde hay C, el rNTP tendrá G, y se unirán por uniones no covalentes. La unión de polimerización es la formación del enlace fosfodiéster (no covalente).

El enlace fosfodiéster que se forma tiene menor energía de unión que el enlace con el fosfato, por lo cual se favorece la polimerización. Por otro lado el grupo pirofosfato es clivado por una enzima, una pirofosfatasa, que también libera más energía.

Las hebras de ARN siempre se sintetizan en dirección 5'→3' y son opuestas en polaridad a sus hebras molde de ADN.

El sitio donde se inicia la transcripción, por convención, se denomina como posición +1. Todas las bases o los nucleótidos (en el ADN) que se encuentran en dirección al extremo 3' (a la síntesis) se denominan posiciones corriente abajo y se denominan son signo +. Lo que está en dirección opuesta se denomina corriente arriba y su nomenclatura es con signo -.

Estructura del ARN.

La pentosa que participa en la estructura de la molécula de ARN es una ribosa que contiene un grupo -OH en el C2'.

Este -OH es muy importante porque hace que el ARN tenga mayor labilidad química (en solución alcalina se hidroliza).
Este -OH es muy importante porque hace que el ARN tenga mayor labilidad química; en solución alcalina el ARN se hidroliza. Cuando queremos obtener ARN de una muestra hay que tener mucho cuidado porque justamente por ser tan lábil se puede destruir y perder muestra.
Además de la mayor labilidad química, ese -OH le da una gran reactividad química a la molécula, de hecho el ARN tiene actividad del tipo catalítica.

Para comparar la estructura primaria del ARN y el ADN, además de la ribosa y la desoxiribosa, recordemos que en el ARN en lugar de timina (T) se encuentra uracilo (U) y además el ARN está formado por una única hebra. Las estructuras primarias de ambos ácidos nucleicos son muy similares: en ambos casos los monómeros son nucleótidos y se polimerizan con la misma direccionalidad (5'→3'); lo que es diferente es la estructura secundaria.

Los dos motivos de estructura secundaria del ARN (en este caso más aplicado al ARNm pero vale para los otros tipos de ARN) más conocidos son la horquilla y el tallo-bucle. Ambos motivos de estructura secundaria se forman por apareamientos de bases complementarias dentro de la misma cadena (el ARN es monocatenario).
En la horquilla estos apareamientos complementarios están separados entre sí por pocos nucleótidos y en el caso del tallo-bucle, estas interacciones están separadas entre sí por lo que se llama bucle, que puede tener hasta cientos de nucleótidos. Esto constituye la estructura secundaria del ARN.

A su vez esta estructura puede plegarse para dar estructuras un poco más complejas como lo que se ve en la figura, que se denomina pseudonudo.

Siempre la estructura secundaria del ARN está basada en estos apareamientos complementarios intracatenarios entre las bases.

La estructura terciaria del ARN es fundamental para que cada uno de los tipos de ARN puedan cumplir con su función adecuada. Como ya se mencionó antes, existe el ARN con capacidad catalítica, gracias a esa mayor reactividad química que posee gracias a ese -OH en el C2' de la ribosa. El ARN con capacidad catalítica se denomina ribozima (es como una función enzimática pero realizada por un ácido nucleico) y en general estos ribozimas están formados por ARN acompañados de proteínas, sin embargo, en esos casos cuando hablamos de ribozimas, la molécula que tiene la actividad catalítica es el ARN no la proteína.

ADN circular.

Algunas moléculas de ADN son circulares.

Las moléculas de ADN de las mitocondrias y cloroplastos, y el ADN genómico procarionte son circulares. También algunos ADN virales son circulares.

El ADN circular puede estar superenrollado o como un círculo relajado. La figura (a) es una microfotografía electrónica del ADN viral del SV40 (virus que se encuentra en monos). Es importante tener conocimientos básicos sobre los virus porque son herramientas muy importantes para la biología molecular.
Normalmente en el caso de un ADN circular, cuando se abre transitoriamente la doble hélice en un punto, para que ese ADN se replique o se transcriba, se producen superenrollamientos en otras partes de la molécula. Estos superenrollamientos se alivian gracias a la presencia de enzimas que son las topoisomerasas que lo que hacen generalmente es romper un enlace fosfodiéster en una de las hebras generando lo que se conoce como muesca, de manera tal que esa estructura se pueda relajar. Algunas topoisomerasas cortan a nivel de una de las hebras y otras a nivel de las dos.

Existen otros tipos de enzimas que son las ligasas, que son las encargadas de volver a formar el enlace fosfodiéster para que nuevamente la molécula tenga la estructura circular.
Si bien aquí se ve que este superenrollamiento se produce en una molécula de ADN viral, en las células eucariontes también se producen superenrollamientos con lo cual estas enzimas, las topoisomerasas y las ligasas, son muy importantes y están en muy alta concentración dentro del núcleo de las células.

En algunos casos, la topoisomerasa cumple ambas funciones: cortar y unir la molécula de ADN. Un ejemplo es la topoisomerasa II.

Desnaturalización o fusión del ADN.

Las hebras del ADN pueden separarse de manera reversible.

La separación de las dos hebras de la doble hélice se conoce como desnaturalización o fusión del ADN.

Por ejemplo, durante la replicación y durante la transcripción las dos hebras de ADN se separan transitoriamente, pero también este fenómeno de desnaturalización (o fusión) se puede producir in vitro, por ejemplo, aumentando la temperatura, porque si la doble hélice está estabilizada por uniones del tipo no covalentes, lo que hacemos es aumentar la energía de modo tal de superar esa energía de unión para que la doble hélice se desarme.
De hecho, aumentando la temperatura de una solución de una muestra de ADN se puede monitorear este fenómeno de desnaturalización midiendo la absorción de luz a 260nm (espectro UV).

Si tenemos una hebra de ADN bicatenario ya de por sí, a baja temperatura, tiene una absorbancia basal muy baja. ¿Por qué es baja? porque lo que absorbe al UV son las bases nitrogenadas (anillos con dobles enlaces conjugados), pero cuando la molécula no está desnaturalizada, las bases están hacia el interior de la molécula, enmascaradas, con lo cual la absorbancia a esa longitud de onda es muy baja. Durante un rango bastante amplio de temperatura no se modifica esto, pero a partir de cierta temperatura (alrededor de los 80°C) aumentando un poco la temperatura aumenta mucho la absorbancia. A medida que empieza a abrirse la doble hélice, rápidamente este fenómeno se sigue produciendo hasta que llega a un valor máximo cuando se completó la desnaturalización.

Se define temperatura de fusión del ADN (Tm), a la temperatura a la cual la mitad de las bases (de los nucleótidos) están desnaturalizados.
Esta temperatura de fusión es una característica de las muestras de ADN, es un parámetro que puede servir para caracterizar una muestra.
Podemos ver qué sucede con el ADN monocatenario: su absorbancia es mucho mayor que el del ADN bicatenario, y a medida que aumenta la temperatura, si bien aumenta un poco la absorbancia, lo hace en baja proporción, casi no aumenta. Este ligero aumento se puede dar porque puede haber apareamientos intracatenario de bases y a medida que se abre se produce un pequeño incremento en la absorbancia.

La Tm es un parámetro para caracterizar una muestra de ADN. Depende a su vez de varios parámetros, uno de los más importantes, que va a determinar cuál es la Tm de una muestra de ADN es el contenido de pares de bases C≡G. En el gráfico vemos que a mayor porcentaje de pares de bases C≡G, mayor es la Tm, porque C≡G forman tres puentes de hidrógeno, a diferencia del par A=T que sólo forma dos, por lo tanto, a mayor cantidad de pares de bases C≡G, mayor cantidad de puentes de hidrógenos, y esto hace que sea más difícil separar esas dos hebras de ADN, necesitando mayor energía (lo que provoca mayor Tm).

Tm depende de varios factores.

• Porcentaje de pares de bases C≡G.
•  Concentración de iones: normalmente, en las células, las moléculas de ADN se encuentran cargadas negativamente (por sus grupos fosfatos) y estas cargas están estabilizadas por iones de carga opuesta (cargas positivas), por ejemplo Mg²⁺ . En consecuencia si disminuye la fuerza iónica de la solución de ADN, disminuye la concentración de cargas positivas que estabilizan la molécula, aumentan las fuerzas de repulsión, y así esta estructura es menos estable.
• Presencia de agentes que desestabilizan las uniones puentes de hidrógeno: a veces según los protocolos de trabajo, es necesario usar urea y formaldehído, que son agentes que desestabilizan este tipo de interacciones, por lo cual también disminuye la Tm (es más fácil la apertura de la doble hélice).
• pH: las bases nitrogenadas, a pH ácido se pueden protonar, por lo cual va a haber repulsión. Lo mismo sucede a pH alcalino: a pH alcalino pierden protones y las cargas negativas van a repelerse entre sí desestabilizando la estructura.

Todos estos parámetros son importantes para considerar la Tm, por eso si medimos la Tm de una muestra in vitro tenemos que tener en cuenta cuál es la concentración de iones de la muestra, el pH, etc.

Renaturalización del ADN.

En condiciones apropiadas el ADN puede renaturalizarse.
El proceso de desnaturalización-renaturalización del ADN es lo que se conoce como hibridación de los ácidos nucleicos.
Esta es la base de muchas de las técnicas y metodologías del ADN recombinante. Estas técnicas son muy importantes en biología molecular porque permiten, por ejemplo:

• El estudio de la relación entre dos muestras de ADN.
• Detección y aislamiento de moléculas específicas de ADN en una muestra compleja → si tenemos una muestra compleja de ADN, para ver si hay una determinada secuencia de ADN podemos utilizar una secuencia complementaria marcada y ver si hibrida.