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domingo, 17 de agosto de 2014

Desnaturalización o fusión del ADN.

Las hebras del ADN pueden separarse de manera reversible.

La separación de las dos hebras de la doble hélice se conoce como desnaturalización o fusión del ADN.

Por ejemplo, durante la replicación y durante la transcripción las dos hebras de ADN se separan transitoriamente, pero también este fenómeno de desnaturalización (o fusión) se puede producir in vitro, por ejemplo, aumentando la temperatura, porque si la doble hélice está estabilizada por uniones del tipo no covalentes, lo que hacemos es aumentar la energía de modo tal de superar esa energía de unión para que la doble hélice se desarme.
De hecho, aumentando la temperatura de una solución de una muestra de ADN se puede monitorear este fenómeno de desnaturalización midiendo la absorción de luz a 260nm (espectro UV).




Si tenemos una hebra de ADN bicatenario ya de por sí, a baja temperatura, tiene una absorbancia basal muy baja. ¿Por qué es baja? porque lo que absorbe al UV son las bases nitrogenadas (anillos con dobles enlaces conjugados), pero cuando la molécula no está desnaturalizada, las bases están hacia el interior de la molécula, enmascaradas, con lo cual la absorbancia a esa longitud de onda es muy baja. Durante un rango bastante amplio de temperatura no se modifica esto, pero a partir de cierta temperatura (alrededor de los 80°C) aumentando un poco la temperatura aumenta mucho la absorbancia. A medida que empieza a abrirse la doble hélice, rápidamente este fenómeno se sigue produciendo hasta que llega a un valor máximo cuando se completó la desnaturalización.

Se define temperatura de fusión del ADN (Tm), a la temperatura a la cual la mitad de las bases (de los nucleótidos) están desnaturalizados.
Esta temperatura de fusión es una característica de las muestras de ADN, es un parámetro que puede servir para caracterizar una muestra.
Podemos ver qué sucede con el ADN monocatenario: su absorbancia es mucho mayor que el del ADN bicatenario, y a medida que aumenta la temperatura, si bien aumenta un poco la absorbancia, lo hace en baja proporción, casi no aumenta. Este ligero aumento se puede dar porque puede haber apareamientos intracatenario de bases y a medida que se abre se produce un pequeño incremento en la absorbancia.


La Tm es un parámetro para caracterizar una muestra de ADN. Depende a su vez de varios parámetros, uno de los más importantes, que va a determinar cuál es la Tm de una muestra de ADN es el contenido de pares de bases C≡G. En el gráfico vemos que a mayor porcentaje de pares de bases C≡G, mayor es la Tm, porque C≡G forman tres puentes de hidrógeno, a diferencia del par A=T que sólo forma dos, por lo tanto, a mayor cantidad de pares de bases C≡G, mayor cantidad de puentes de hidrógenos, y esto hace que sea más difícil separar esas dos hebras de ADN, necesitando mayor energía (lo que provoca mayor Tm).

Tm depende de varios factores.

  • Porcentaje de pares de bases C≡G.
  •  Concentración de iones: normalmente, en las células, las moléculas de ADN se encuentran cargadas negativamente (por sus grupos fosfatos) y estas cargas están estabilizadas por iones de carga opuesta (cargas positivas), por ejemplo Mg2+ . En consecuencia si disminuye la fuerza iónica de la solución de ADN, disminuye la concentración de cargas positivas que estabilizan la molécula, aumentan las fuerzas de repulsión, y así esta estructura es menos estable.
  • Presencia de agentes que desestabilizan las uniones puentes de hidrógeno: a veces según los protocolos de trabajo, es necesario usar urea y formaldehído, que son agentes que desestabilizan este tipo de interacciones, por lo cual también disminuye la Tm (es más fácil la apertura de la doble hélice).
  • pH: las bases nitrogenadas, a pH ácido se pueden protonar, por lo cual va a haber repulsión. Lo mismo sucede a pH alcalino: a pH alcalino pierden protones y las cargas negativas van a repelerse entre sí desestabilizando la estructura.
Todos estos parámetros son importantes para considerar la Tm, por eso si medimos la Tm de una muestra in vitro tenemos que tener en cuenta cuál es la concentración de iones de la muestra, el pH, etc.

Renaturalización del ADN.

En condiciones apropiadas el ADN puede renaturalizarse.
El proceso de desnaturalización-renaturalización del ADN es lo que se conoce como hibridación de los ácidos nucleicos.
Esta es la base de muchas de las técnicas y metodologías del ADN recombinante. Estas técnicas son muy importantes en biología molecular porque permiten, por ejemplo:

  • El estudio de la relación entre dos muestras de ADN.
  • Detección y aislamiento de moléculas específicas de ADN en una muestra compleja → si tenemos una muestra compleja de ADN, para ver si hay una determinada secuencia de ADN podemos utilizar una secuencia complementaria marcada y ver si hibrida.

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