Regulación covalente de proteínas: fosforilación/defosforilación.

Ocurre la formación de un enlace covalente entre un -OH de un aminoácido (en general Ser, Thr o hidroxilisina); en esos aminoácidos se puede unir un fosfato.

La enzima, cuando tiene el -OH libre está activa. Este -OH se fosforila, con esto hay un cambio en la secuencia primaria, y consecuencia de esto, cambia su conformación. La fosforilación es a través de proteínas cinasas y se inactiva. Para que vuelva a su estado activo, hay otras proteínas que eliminan el fosfato. Muchos de estos mecanismos se ven en la regulación del ciclo celular.

Siempre que haya una proteincinasa, hay una fosfatasa para balancear.

En general, las proteínas se activan por fosforilación y se desactivan por defosforilación, pero en este ejemplo, se ve al revés.

Proteínas G.

Se llaman proteínas G porque unen GTP (nucleótidos de guanina). Estas proteínas G unen GTP o GDP y van a cambiar la forma y como consecuencia de esto, cambian su función. En el caso de proteínas G, la unión de GTP las activa: una proteína G unida a GTP está en su estado activo, mientras que una proteína G unida a GDP está en su estado inactivo. La proteína G activa, cambia su conformación, se une a una proteína inactiva y la activa. Hay proteínas que inducen la hidrólisis de GTP a GDP para que se inactive (ejemplo: GAP, RGS).

Para que la proteína se active, hay proteínas que son “factores de intercambio de nucleótidos” (GEF) que permiten el cambio de GDP por GTP.

Las proteínas G al unirse a un ligando (GTP) se activan para activar otras proteínas.

Tanto las proteínas G como la calmodulina, al unir un ligando, cambian la conformación y se activan para activar así otras proteínas.

Hay dos tipos de proteínas G: las monoméricas (ejemplo: RAS, RHO) y las triméricas, que son las que participan en el mecanismo de AMPc.

Especificidad y afinidad (II). Alosterismo.

Las proteínas son capaces de interactuar con toda molécula concebible.

ESPECIFICIDAD: se refiere a la capacidad de una proteína de unir una molécula con preferencia a otra molécula; depende de la complementariedad molecular. Esta complementariedad molecular también da idea de la afinidad.

AFINIDAD: se refiere a la fuerza de unión (mayor complementariedad molecular, mayor afinidad de la interacción de dos proteínas).

Cuanto mayor es la afinidad menor es el valor de la K_D.

La afinidad depende de la estructura de la proteína, porque la complementariedad molecular depende de la forma y de la molécula, depende de la cantidad de interacciones débiles que pueden establecerse entre estas dos moléculas.

La especificidad depende de la forma y la afinidad depende de la fuerza de unión entre moléculas, y en general depende de la cantidad de interacciones que se pueden establecer entre dos moléculas.

EJEMPLOS.

• ANTICUERPOS. Son proteínas que sintetiza nuestro organismo como respuesta a un agente invasor. En general, ese anticuerpo tiene una alta afinidad y especificidad para unirse al agente invasor contra el que fue desarrollado; cada anticuerpo puede unirse a una región levemente diferente, o epítopo, del antígeno.

El anticuerpo puede ser representado como una Y.

Posee dos cadenas pesadas (rojas) y dos cadenas livianas (azules), son en total 4 cadenas (jerarquía: estructura cuaternaria). La estructura terciaria se encuentra estabilizada por puentes disulfuro.

En la imagen vemos la disposición espacial que adquiere el anticuerpo. Vemos las cadenas livianas, las cadenas pesadas, un carbohidrato y puentes disulfuro intercatenarios. Además tenemos el CDR. El CDR es la región determinante de la complementariedad, es decir, es donde se va a unir el antígeno. El antígeno es la molécula que va a reconocer al anticuerpo, es el agente infeccioso.

El anticuerpo tiene hojas β (estructura secundaria), prácticamente no hay α-hélices. A simple vista podemos reconocer dominios: un dominio formado por las cadenas pesadas y dos dominios formados por las cadenas pesadas y livianas donde se encuentran los CDR.

En las CDR, en general, hay seis bucles (estructura secundaria). Estos bucles son muy variables, es decir que cada antígeno va a inducir que se sintetice un anticuerpo donde en esos bucles haya una estructura primaria diferente. Estos bucles son diferentes para cada antígeno; como cada bucle tendrá una estructura primaria diferente, entonces tendrá una forma diferente, de esta manera van a buscar la forma que va a ser complementaria de el antígeno y de esa manera lo va a poder neutralizar. Cuando nos infecta una bacteria, la bacteria en su superficie tiene proteínas y éstas son las que inducen la síntesis de los anticuerpos (las moléculas que inducen la síntesis de anticuerpos se denominan antígenos); por esto se habla de la interacción antígeno-anticuerpo, y es una de las interacciones de la biología de la más alta especificidad y afinidad.Un antígeno puede producir varios anticuerpos para distintas regiones de una misma proteína, de manera tal que para un antígeno el organismo genera una respuesta que se denomina anticuerpo policlonal: muchos anticuerpos de distinta especificidad, porque reconocen diferentes zonas de la molécula que contribuyen a neutralizar al agente patógeno.

 • Otro ejemplo de especificidad es el de las enzimas. La mayoría de las reacciones de biosíntesis o biodegradación en el organismo es mediado por enzimas.

En el laboratorio de química inorgánica, cuando queremos acelerar una reacción, agregamos un catalizador, por ejemplo zinc, o podemos calentar el tubo de reacción para aumentar el movimiento de las molpeculas y así aumenta la energía de activación y así las moléculas reaccionan. En un organismo vivo esto no lo podemos hacer. El el organismo no se puede aumentar la temperatura y tampoco se pueden utilizar catalizadores inorgánicos. Entonces, los organismos usan otros catalizadores, las enzimas. Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan la velocidad de las reacciones. Son otro perfecto ejemplo de la especificidad entre un sustrato (S) y la enzima (E). 

Las enzimas poseen sitios de unión, sitios donde se unirán los sustratos, y esto forma el sitio activo que es el sitio donde se lleva a cabo la reacción. En algunas enzimas el sitio activo forma parte del sitio de unión del sustrato, pero en otras enzimas, las dos regiones son, de manera estructural y funcional, diferentes.

En los sitios de unión de las enzimas hay complementariedad molecular entre el sitio de unión y los sustratos. Cuanto mejor sea el “encastre” de uno con el otro, a mayor cantidad de interacciones que ocurran, mayor será la afinidad.A veces la afinidad es tan grande que el sustrato se une al sitio activo y no sale más (hablamos así de un inhibidor).

Las enzimas no cambian la energía libre de la reacción, es decir que la energía libre de la reacción es la misma. Lo que disminuye es la energía de activación; porque el hecho de acercar los sustratos ya está haciendo que los complejos S-E estén próximos y puedan reaccionar fácilmente.

No se conoce muy bien el mecanismo cómo actúan las enzimas. Pero hay 3 teorías que proponen mecanismos por los cuales actúan las enzimas:

– Una teoría dice que se alinean los sustratos, es decir que los pone en la posición correcta en que tienen que reaccionar.

– Otra teoría dice que hay sustratos que necesitan ser, por ejemplo, degradados cuando hay un cambio de pH. Las células no cambian el pH pero las enzimas en su sitio activo pueden tener aminoácidos cargados con H⁺ y esos H⁺ pueden ser cedidos al intermediario de reacción, de esta manera lo que se carga es el sustrato y así se encuentra en una forma molecular más propicia para reaccionar, hidrolizarse, o lo que sea que deba ocurrir.

– La otra teoría es la inducción del cambio conformacional. Dice que cuando el sustrato se une a la enzima, ésta automáticamente cambia su conformación y genera a su vez cambios sobre el sustrato.

Proteincinasa A (PKA).

La PKA es una cinasa. Las cinasas son enzimas que fosforilan proteínas. Los aminoácidos con grupos -OH libres son susceptibles a la fosforilación, es decir que los aminoácidos Ser, Thr y Tyr pueden ser fosforilados.
La PKA es un enzima dependiente de AMPc; el AMPc es un segundo mensajero que induce la activación de la proteína PKA.

La PKA consta de cuatro subunidades: dos subunidades reguladoras y dos subunidades catalíticas. El AMPc se produce en la célula en respuesta a un estímulo extracelular, entonces cuando se produce el AMPc, se “encastra” en las subunidades reguladoras y genera un cambio conformacional, y así libera a las subunidades catalíticas que son las encargadas de la fosforilación de otras proteínas.

En la figura vemos la estructura de la PKA (superficie expuesta al solvente). Vemos una de las subunidades catalíticas. Posee un dominio pequeño y un dominio grande (estructuras terciarias bien diferenciadas). En el dominio pequeño hay una región que se denomina tapa de glicina (azul) y en esta región es donde interactúa con adenina. Como debe fosforilar, para esto precisa ATP. El dominio grande posee una región donde se va a ubicar el péptido diana (que va a ser fosforilado).

El sitio activo de la PKA está localizado en el residuo 240, “núcleo de cinasa”, de la subunidad catalítica. Este núcleo de cinasa es responsable de la unión de sustratos (ATP y una secuencia peptídica diana) y la subsiguiente transferencia de un grupo fosfato del ATP a un residuo de Ser, Thr o Tyr en la secuencia diana. El núcleo de cinasa consiste en un dominio grande y uno pequeño, con una hendidura intermedia profunda; el sitio activo comprende los residuos ubicados en ambos dominios.

Cuando la proteína está inactiva, tenemos el dominio pequeño, grande, el loop que conecta ambos dominios (es una sola cadena que consta de dos dominios) y tenemos la tapa de glicina donde se une el ATP; y en el dominio grande se une el péptido que será fosforilado. Cuando se une el péptido y el ATP, la PKA cambia la conformación, se cierra la tapa (el dominio pequeño se ubica sobre el dominio grande) y de esa manera se acerca el ATP al péptido diana y ocurre así la reacción de fosforilación.

ALOSTERISMO: cualquier cambio en la estructura terciaria o cuaternaria de una proteína que modifica su actividad, inducida por la unión NO covalente de ligandos.

La unión de un ligando puede activar o inhibir la actividad de una proteína.

Por ejemplo, tenemos una enzima donde se unen dos sustratos A y B para generar un producto C. Posee una región que se llama centro regulador. En este centro encaja un ligando, hay un cambio conformacional y los sitios de unión cambian de forma y los sustratos no se unen; por lo tanto, este ligando, alostéricamente inhibió la actividad de esta proteína (enzima).

Hemoglobina (Hb).

En este caso además de alosterismo hay cooperatividad. La hemoglobina tiene una estructura cuaternaria formada por dos subunidades α y dos subunidades β. Cada subunidad de la hemoglobina tiene un grupo prostético que es el grupo hemo. Cada hemo tiene la capacidad de unir un O₂

En el caso de la hemoglobina la unión de un primer oxígeno induce un cambio conformacional en esta subunidad y este cambio conformacional va a inducir la exposición del sitio donde se va a unir el segundo oxígeno, es decir que el primer oxígeno está ayudando a la unión del segundo oxígeno y éste a su vez induce el cambio conformacional para exponer el sitio de unión del tercer oxígeno, y así sucesivamente hasta el cuarto oxígeno. Entonces es una secuencia de cambios conformacionales, los cuales, es este caso, están aumentando la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno. Este mecanismo se denomina unión cooperativa. Esto es muy importante porque bajas concentraciones de oxígeno permiten inducir los cambios conformacionales necesarios para que la hemoglobina se sature.


Otro ejemplo:

Este ejemplo es el visto anteriormente:

Es el típico ejemplo de activación por la unión de un ligando. La generación de AMPc frente a un estímulo extracelular. El AMPc se va a unir a sitios en la subunidad reguladora de la PKA inactiva que está secuestrando a las subunidades catalpíticas a través de una región que se denomina pseudosustrato. Cuando el AMPc se une, se liberan las subunidades catalíticas y ocurre la señalización celular.

Nota: Proceso celular: La membrana celular con proteínas transmembranas (proteínas receptoras) va a recibir un estímulo en la superficie celular, que es una molécula. Como consecuencia, la molécula (los receptores tienen la especificidad y la afinidad por los ligandos de la superficie celular) no se unen a cualquier otra molécula. La interacción entre el receptor y el ligando produce un cambio conformacional en el receptor. El receptor se encuentra unido a unas proteínas (son proteínas G, que son transductoras de señales) y como consecuencia del cambio conformacional del receptor, se activan estas proteínas G, lo que activa a su vez a la enzima adenilato ciclasa y genera a partir de ATP, AMPc y así sigue la cadena ya descripta.
Esta señal debe desaparecer, si dura mucho tiempo, la célula se verá afectada. Por eso hay enzimas como la fosfodiesterasa que degrada al AMPc para que finalice el proceso.

 
Otro ejemplo de alosterismo:

El Ca²⁺ es un modulador de la actividad enzimática por excelencia. Es un modulador metabólico. Muchísimos procesos biológicos están mediados por
Ca²⁺ , por ejemplo, la coagulación. Cuando se corta la cascada de coagulación se activa un Ca²⁺ . Cuando se extrae sangre hay que colocar en el tubo de ensayo una sustancia que bloquee el calcio para que no se coagule la sangre.

El calcio, en general, es un activador de las actividades enzimáticas dentro de la célula; por esto la concentración de Ca²⁺ dentro de la célula es muy baja. El Ca²⁺ no puede estar libre en el citosol porque activa proteasas, fosfolipasas, activa todo lo que encuentre en la célula. Entonces ¿dónde está el calcio?: El mayor reservorio de calcio en la célula son las cisternas del RE (Ca²⁺ que se puede movilizar, porque el mayor reservorio de Ca²⁺ en sí es la mitocondria). El Ca²⁺  se puede movilizar del RE al citosol y viceversa. Ante determinados estímulos como el AMPc, aumenta la concentración de calcio en el citosol. Este Ca²⁺ en general, está unido a proteínas que tienen un motivo “mano EF” (combinaciones de estructuras secundarias) que es característica en proteínas que unen calcio. Hay una proteína que es unidora por excelencia: la calmodulina.

La calmodulina tiene la capacidad de unir cuatro Ca²⁺ (tiene cuatro motivos “mano EF”). Cuando la calmodulina une los cuatro Ca²⁺ cambia la conformación. Es un cambio conformacional inducido por Ca²⁺: regulación no covalente de tipo alostérica. La calmodulina, una vez que cambia la conformación, va a tener la capacidad de unirse a otro péptido, en general son las CaM Kinasas (cinasas moduladas por calmodulina). La enzima para ser activa debe unirse a la calmodulina unida al Ca²⁺.

Regulación de la actividad de las proteínas.

La forma de las proteínas determina la función.
Puede ser regulada no covalentemente por un fenómeno que se denomina alosterismo. También puede ser regulada covalentemente, por ejemplo, por fosforilación/defosforilación o ubicuitinización/deubicuitinización.

La proteólisis es la ruptura de una cadena polipeptídica en segmentos. Puede ocurrir que esa proteólisis degrade la proteína y no actúe más, entonces de esa manera, la célula puede disminuir la actividad de la proteína al inducir la degradación. Hay otros casos donde a través del mecanismo de proteólisis la célula activa la función de la proteína, estos casos son los de la tripsina y quimotripsina. Éstas son enzimas sintetizadas por células pancreáticas (son enzimas digestivas), pero no se sintetizan como enzimas activas sino que son sintetizadas como tripsinógeno y quimotripsinógeno (estas enzimas inactivas son conocidas como cimógenos). Estas enzimas son almacenadas dentro de un gránulo. Cuando llega el estímulo del alimento, se activa la secreción del cimógeno, y cuando éste cimógeno es secretado se cliva el quimotripsinógeno, para convertir esta enzima inactiva en activa, y esto ocurre así porque estas enzimas degradan todas las proteínas y si se activaran antes de ser liberadas, degradarían al propio páncreas (esto es lo que sucede en la pancreatitis. Las enzimas pancreáticas (especialmente la tripsina) que digieren la comida se activan en el páncreas en lugar de hacerlo en el intestino delgado). Otras enzimas, las caspasas, son enzimas que se activan cuando se activa el programa de muerte celular, y se sintetizan como procaspasas; estas enzimas deben estar inactivas hasta que se activa la muerte celular, entonces las células activan los mecanismos que las clivan y de esa manera las transforma en activas.

Degradación de proteínas.

Para que las proteínas puedan ser degradadas en los proteasomas (grandes estructuras moleculares) deben ser modificadas.
Una proteína diana debe ser degradada. Para ser degradada en el proteasoma necesita ser marcada. De alguna manera la célula debe saber qué proteína debe degradar, porque si no podría degradar proteínas que no deben ser degradadas.
Entonces la célula marca a la proteína diana con otra proteína, muy pequeña, que se llama ubicuitina (Ub).

Esta proteína posee 76 aminoácidos y tiene una masa de 8,6kDa; es realmente muy pequeña.
Esta proteína Ub se va a ir uniendo a restos NH₂ de las Lys de la proteína que debe ser degradada.

La enzima E1 es la enzima activadora de Ub. Cuando se hidroliza ATP, la Ub se une a E1y ésta la transfiere la enzima E2 (enzima conjugadora de Ub). Esta enzima E2 actúa como un intermediario para que la Ub pueda ser transferida a la proteína:

La Ub se une a la proteína diana (al resto -NH₂ de los residuos de Lys) gracias a una enzima, la E3 (enzima ubicuitina ligasa). La E3 une Ub, paso que se repite muchas veces, y así la proteína tendrá muchas subunidades de Ub.
Una vez que la proteína fue marcada con varias subunidades de Ub, esta cadena de poliubicuitina dirige a la proteína marcada hacia los proteasomas donde será degradada a péptidos menores.
Todas estas enzimas: E1, E2 y E3, actúan secuencialmente.

Las proteínas citosólicas nativas cuya duración de vida es estrictamente controlada y las proteínas que se pliegan erróneamente durante su síntesis en el RE son degradadas por esta vía.

Estructura del proteasoma:

Mecanismo del proteasoma:

 

Modificaciones químicas en las proteínas.

Los aminoácidos que forman parte de una proteína pueden ser modificados.

Una vez que los aminoácidos se encuentran insertos en las proteínas pueden ser modificados. Si se modifica la estructura del aminoácido, por ejemplo, se acetila, fosforila o hidroxila, entonces cambia su estructura primaria, por ende cambia también la estructura terciaria. Entonces estas modificaciones contribuyen a regular la función de la proteína.

Esto es muy importante. Por ejemplo, la fosforilación/defosforilación es un mecanismo por el cual se regula la actividad proteica.

NOTA: Para que un aminoácido pueda ser fosforilado debe tener en su resto lateral un grupo -OH, es decir que serán fosforilados los aminoácidos: serina, treonina, tirosina e histidina.

Hay otras modificaciones muy importantes:

• Lipidación: ayuda a la proteína a insertarse en una membrana. Es también una forma de regular la actividad, como en el tránsito vesicular, donde hay proteínas G pequeñas que tienen colas de ácidos grasos y cuando se exponen son capaces de insertarse en la membrana o en la vesícula que tiene que ser transportada o gemada.

• Glucosilación: sólo se glucosilan los dominios exteriores o exoplasmáticos de las proteínas.

• Ubicuitinización: H₂N-Lys

• Procesamientos:

– Enzimático-proteólisis.

– Zimógenos.

– Pre-EGF.

– Procaspasas.

Todas estas modificaciones afectan la estructura primaria y por lo tanto se modifica también la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, afectando así su función.

Plegamiento de las proteínas in vivo: las chaperonas

Estas chaperonas aumentan la velocidad del plegamiento y, lo más importante, direccionan el plegamiento de tal manera que se pliegan correctamente. Se reconocen dos familias generales de chaperonas:

Una proteína que se encuentre mal plegada puede ser perjudicial para la célula, por lo tanto, ésta procede rápidamente a su degradación.

Plegamiento de proteínas mediado por chaperonas y chaperoninas.

En esta figura vemos un ribosoma que empieza a sintetizar una proteína. Este péptido naciente que emerge de la subunidad mayor del ribosoma puede tener en su secuencia de aminoácidos restos no polares (es decir, secuencias del tipo hidrofóbicas).
El ribosoma puede encontrarse libre en el citosol o unido a un translocón en la membrana del RE. Sea cual fuere el medio, el interior del translocón o el citosol, es un medio acuoso, por lo tanto, si se expone una secuencia hidrófoba a un medio acuoso, energéticamente es desfavorable, y puede ocurrir que la proteína comience a agregarse (esto es que se pliegue en una forma errónea) para disminuir esta alta energía libre que se expone cuando los restos hidrofóbicos se encuentran en medio acuoso.
Entonces, a medida que la cadena polipeptídica va emergiendo, las Hsp70 (que se encuentran unidas a ATP) se van uniendo a dominios de unión a secuencias hidrofóbicas y evita que la proteína se pliegue de manera errónea.
Quizás la proteína precisa estar completamente sintetizada para plegarse correctamente pero si a medida que se va formando se agrega, no se va a poder plegar correctamente.

Aquí vemos el proceso con más detalle. Tenemos el ribosoma y de él emerge una cadena polipeptídica, una proteína parcialmente plegada.
La Hsp70 es una proteína que contiene dos dominios: un dominio que se une a la cadena polipeptídica y un dominio que se une a ATP.
A medida que nace la cadena polipeptídica, ésta expone secuencias hidrofóbicas. El dominio unidor de secuencias hidrofóbicas se une a los dominios hidrofóbicos de la cadena polipeptídica, y luego con la ayuda de co-chaperonas (DnaJ/Hsp40) se induce la hidrólisis de ATP en la chaperona Hsp70.
En general, la hidrólisis de ATP induce cambios conformacionales. Entonces, el ATP se hidroliza a ADP generando un cambio conformacional en la Hsp70. Esto hace que el dominio unidor de secuencias hidrofóbicas se cierre sobre la cadena polipeptídica para protegerla del entorno. Es decir que hay tantas chaperonas Hsp70 como dominios hidrofóbicos contenga la cadena polipeptídica.
Una vez que la cadena polipeptídica se encuentra plegada, hay una proteína intercambiadora de ATP (GrpE/BAG1), que son co-chaperoninas que favorecen el intercambio de ADP por ATP induciendo así un cambio conformacional que permite la liberación de la cadena polipeptídica correctamente plegada.

Este es otro ejemplo. Esta es la chaperona Hsp90. Aquí podemos ver la utilización del ATP.
Esta chaperona posee un dominio unidor de ADP (azul) y un dominio unidor de secuencias hidrofóbicas de la cadena polipeptídica (naranja). Básicamente es lo mismo que lo expuesto anteriormente:
Cuando el dominio unidor de ADP intercambia ADP por ATP, produce un cambio conformacional, el cual permite la interacción del dominio unidor de secuencias hidrofóbicas con la cadena polipeptídica. La interacción de este dominio con la proteína, genera un cambio conformacional que permite que se acerquen los dominios unidores de ATP; y estos dominios de ATP al acercarse generan la hidrólisis del ATP a ADP, generando un cambio conformacional, y esto produce la apertura de la chaperona y la liberación de la cadena polipeptídica correctamente plegada.

Las chaperoninas son agrupaciones macromoleculares.


Poseen dos cámaras. Estas cámaras no funcionan al mismo tiempo, funciona una o la otra. En cada una de estas cámaras, por un mecanismo que se desconoce, ocurre el proceso de plegamiento (se comportan como máquinas de plegamiento de proteínas). La cadena polipeptídica es sintetizada por los ribosomas. Esta cadena se encuentra parcialmente plegada y es captada por una de las cámaras donde será plegada correctamente.
Entonces, la cadena polipeptídica es captada por la cámara superior (o inferior) y en un paso que depende de la hidrólisis de ATP, con una co-chaperonina (GroES), se produce el plegamiento de esta proteína dentro de la cámara.
Una vez que ocurre el plegamiento de la proteína, se hidroliza el ATP, y la proteína ya correctamente plegada es liberada. Puede suceder que se pliegue parcialmente, que sea liberada sin su conformación correcta, y deba repetir el proceso hasta quedar correctamente plegada para que pueda así cumplir su función.

NOTA: Las chaperoninas más conocidas y caracterizadas se encuentran en bacterias pero se han encontrado chaperoninas en células eucariontes (en citosol y RE).