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lunes, 17 de febrero de 2014

Especificidad y afinidad (II). Alosterismo.

Las proteínas son capaces de interactuar con toda molécula concebible.

ESPECIFICIDAD: se refiere a la capacidad de una proteína de unir una molécula con preferencia a otra molécula; depende de la complementariedad molecular. Esta complementariedad molecular también da idea de la afinidad.

AFINIDAD: se refiere a la fuerza de unión (mayor complementariedad molecular, mayor afinidad de la interacción de dos proteínas).






Cuanto mayor es la afinidad menor es el valor de la KD.

La afinidad depende de la estructura de la proteína, porque la complementariedad molecular depende de la forma y de la molécula, depende de la cantidad de interacciones débiles que pueden establecerse entre estas dos moléculas.

La especificidad depende de la forma y la afinidad depende de la fuerza de unión entre moléculas, y en general depende de la cantidad de interacciones que se pueden establecer entre dos moléculas.

EJEMPLOS.

ANTICUERPOS. Son proteínas que sintetiza nuestro organismo como respuesta a un agente invasor. En general, ese anticuerpo tiene una alta afinidad y especificidad para unirse al agente invasor contra el que fue desarrollado; cada anticuerpo puede unirse a una región levemente diferente, o epítopo, del antígeno.
El anticuerpo puede ser representado como una Y.


Posee dos cadenas pesadas (rojas) y dos cadenas livianas (azules), son en total 4 cadenas (jerarquía: estructura cuaternaria). La estructura terciaria se encuentra estabilizada por puentes disulfuro.
En la imagen vemos la disposición espacial que adquiere el anticuerpo. Vemos las cadenas livianas, las cadenas pesadas, un carbohidrato y puentes disulfuro intercatenarios. Además tenemos el CDR. El CDR es la región determinante de la complementariedad, es decir, es donde se va a unir el antígeno. El antígeno es la molécula que va a reconocer al anticuerpo, es el agente infeccioso.
El anticuerpo tiene hojas β (estructura secundaria), prácticamente no hay α-hélices. A simple vista podemos reconocer dominios: un dominio formado por las cadenas pesadas y dos dominios formados por las cadenas pesadas y livianas donde se encuentran los CDR.
En las CDR, en general, hay seis bucles (estructura secundaria). Estos bucles son muy variables, es decir que cada antígeno va a inducir que se sintetice un anticuerpo donde en esos bucles haya una estructura primaria diferente. Estos bucles son diferentes para cada antígeno; como cada bucle tendrá una estructura primaria diferente, entonces tendrá una forma diferente, de esta manera van a buscar la forma que va a ser complementaria de el antígeno y de esa manera lo va a poder neutralizar. Cuando nos infecta una bacteria, la bacteria en su superficie tiene proteínas y éstas son las que inducen la síntesis de los anticuerpos (las moléculas que inducen la síntesis de anticuerpos se denominan antígenos); por esto se habla de la interacción antígeno-anticuerpo, y es una de las interacciones de la biología de la más alta especificidad y afinidad.Un antígeno puede producir varios anticuerpos para distintas regiones de una misma proteína, de manera tal que para un antígeno el organismo genera una respuesta que se denomina anticuerpo policlonal: muchos anticuerpos de distinta especificidad, porque reconocen diferentes zonas de la molécula que contribuyen a neutralizar al agente patógeno.

 • Otro ejemplo de especificidad es el de las enzimas. La mayoría de las reacciones de biosíntesis o biodegradación en el organismo es mediado por enzimas.
En el laboratorio de química inorgánica, cuando queremos acelerar una reacción, agregamos un catalizador, por ejemplo zinc, o podemos calentar el tubo de reacción para aumentar el movimiento de las molpeculas y así aumenta la energía de activación y así las moléculas reaccionan. En un organismo vivo esto no lo podemos hacer. El el organismo no se puede aumentar la temperatura y tampoco se pueden utilizar catalizadores inorgánicos. Entonces, los organismos usan otros catalizadores, las enzimas. Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan la velocidad de las reacciones. Son otro perfecto ejemplo de la especificidad entre un sustrato (S) y la enzima (E). 
Las enzimas poseen sitios de unión, sitios donde se unirán los sustratos, y esto forma el sitio activo que es el sitio donde se lleva a cabo la reacción. En algunas enzimas el sitio activo forma parte del sitio de unión del sustrato, pero en otras enzimas, las dos regiones son, de manera estructural y funcional, diferentes.
En los sitios de unión de las enzimas hay complementariedad molecular entre el sitio de unión y los sustratos. Cuanto mejor sea el “encastre” de uno con el otro, a mayor cantidad de interacciones que ocurran, mayor será la afinidad.A veces la afinidad es tan grande que el sustrato se une al sitio activo y no sale más (hablamos así de un inhibidor).



Las enzimas no cambian la energía libre de la reacción, es decir que la energía libre de la reacción es la misma. Lo que disminuye es la energía de activación; porque el hecho de acercar los sustratos ya está haciendo que los complejos S-E estén próximos y puedan reaccionar fácilmente.

No se conoce muy bien el mecanismo cómo actúan las enzimas. Pero hay 3 teorías que proponen mecanismos por los cuales actúan las enzimas:

– Una teoría dice que se alinean los sustratos, es decir que los pone en la posición correcta en que tienen que reaccionar.

– Otra teoría dice que hay sustratos que necesitan ser, por ejemplo, degradados cuando hay un cambio de pH. Las células no cambian el pH pero las enzimas en su sitio activo pueden tener aminoácidos cargados con H+ y esos H+ pueden ser cedidos al intermediario de reacción, de esta manera lo que se carga es el sustrato y así se encuentra en una forma molecular más propicia para reaccionar, hidrolizarse, o lo que sea que deba ocurrir.

– La otra teoría es la inducción del cambio conformacional. Dice que cuando el sustrato se une a la enzima, ésta automáticamente cambia su conformación y genera a su vez cambios sobre el sustrato.

Proteincinasa A (PKA).


La PKA es una cinasa. Las cinasas son enzimas que fosforilan proteínas. Los aminoácidos con grupos -OH libres son susceptibles a la fosforilación, es decir que los aminoácidos Ser, Thr y Tyr pueden ser fosforilados.
La PKA es un enzima dependiente de AMPc; el AMPc es un segundo mensajero que induce la activación de la proteína PKA.

La PKA consta de cuatro subunidades: dos subunidades reguladoras y dos subunidades catalíticas. El AMPc se produce en la célula en respuesta a un estímulo extracelular, entonces cuando se produce el AMPc, se “encastra” en las subunidades reguladoras y genera un cambio conformacional, y así libera a las subunidades catalíticas que son las encargadas de la fosforilación de otras proteínas.

En la figura vemos la estructura de la PKA (superficie expuesta al solvente). Vemos una de las subunidades catalíticas. Posee un dominio pequeño y un dominio grande (estructuras terciarias bien diferenciadas). En el dominio pequeño hay una región que se denomina tapa de glicina (azul) y en esta región es donde interactúa con adenina. Como debe fosforilar, para esto precisa ATP. El dominio grande posee una región donde se va a ubicar el péptido diana (que va a ser fosforilado).

El sitio activo de la PKA está localizado en el residuo 240, “núcleo de cinasa”, de la subunidad catalítica. Este núcleo de cinasa es responsable de la unión de sustratos (ATP y una secuencia peptídica diana) y la subsiguiente transferencia de un grupo fosfato del ATP a un residuo de Ser, Thr o Tyr en la secuencia diana. El núcleo de cinasa consiste en un dominio grande y uno pequeño, con una hendidura intermedia profunda; el sitio activo comprende los residuos ubicados en ambos dominios.


Cuando la proteína está inactiva, tenemos el dominio pequeño, grande, el loop que conecta ambos dominios (es una sola cadena que consta de dos dominios) y tenemos la tapa de glicina donde se une el ATP; y en el dominio grande se une el péptido que será fosforilado. Cuando se une el péptido y el ATP, la PKA cambia la conformación, se cierra la tapa (el dominio pequeño se ubica sobre el dominio grande) y de esa manera se acerca el ATP al péptido diana y ocurre así la reacción de fosforilación.

ALOSTERISMO: cualquier cambio en la estructura terciaria o cuaternaria de una proteína que modifica su actividad, inducida por la unión NO covalente de ligandos.

La unión de un ligando puede activar o inhibir la actividad de una proteína.

Por ejemplo, tenemos una enzima donde se unen dos sustratos A y B para generar un producto C. Posee una región que se llama centro regulador. En este centro encaja un ligando, hay un cambio conformacional y los sitios de unión cambian de forma y los sustratos no se unen; por lo tanto, este ligando, alostéricamente inhibió la actividad de esta proteína (enzima).



Hemoglobina (Hb).


En este caso además de alosterismo hay cooperatividad. La hemoglobina tiene una estructura cuaternaria formada por dos subunidades α y dos subunidades β. Cada subunidad de la hemoglobina tiene un grupo prostético que es el grupo hemo. Cada hemo tiene la capacidad de unir un O2



En el caso de la hemoglobina la unión de un primer oxígeno induce un cambio conformacional en esta subunidad y este cambio conformacional va a inducir la exposición del sitio donde se va a unir el segundo oxígeno, es decir que el primer oxígeno está ayudando a la unión del segundo oxígeno y éste a su vez induce el cambio conformacional para exponer el sitio de unión del tercer oxígeno, y así sucesivamente hasta el cuarto oxígeno. Entonces es una secuencia de cambios conformacionales, los cuales, es este caso, están aumentando la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno. Este mecanismo se denomina unión cooperativa. Esto es muy importante porque bajas concentraciones de oxígeno permiten inducir los cambios conformacionales necesarios para que la hemoglobina se sature.


Otro ejemplo:

Este ejemplo es el visto anteriormente:



Es el típico ejemplo de activación por la unión de un ligando. La generación de AMPc frente a un estímulo extracelular. El AMPc se va a unir a sitios en la subunidad reguladora de la PKA inactiva que está secuestrando a las subunidades catalpíticas a través de una región que se denomina pseudosustrato. Cuando el AMPc se une, se liberan las subunidades catalíticas y ocurre la señalización celular.

Nota: Proceso celular: La membrana celular con proteínas transmembranas (proteínas receptoras) va a recibir un estímulo en la superficie celular, que es una molécula. Como consecuencia, la molécula (los receptores tienen la especificidad y la afinidad por los ligandos de la superficie celular) no se unen a cualquier otra molécula. La interacción entre el receptor y el ligando produce un cambio conformacional en el receptor. El receptor se encuentra unido a unas proteínas (son proteínas G, que son transductoras de señales) y como consecuencia del cambio conformacional del receptor, se activan estas proteínas G, lo que activa a su vez a la enzima adenilato ciclasa y genera a partir de ATP, AMPc y así sigue la cadena ya descripta.
Esta señal debe desaparecer, si dura mucho tiempo, la célula se verá afectada. Por eso hay enzimas como la fosfodiesterasa que degrada al AMPc para que finalice el proceso.



 
Otro ejemplo de alosterismo:

El Ca2+ es un modulador de la actividad enzimática por excelencia. Es un modulador metabólico. Muchísimos procesos biológicos están mediados por
Ca2+ , por ejemplo, la coagulación. Cuando se corta la cascada de coagulación se activa un Ca2+ . Cuando se extrae sangre hay que colocar en el tubo de ensayo una sustancia que bloquee el calcio para que no se coagule la sangre.

El calcio, en general, es un activador de las actividades enzimáticas dentro de la célula; por esto la concentración de Ca2+ dentro de la célula es muy baja. El Ca2+ no puede estar libre en el citosol porque activa proteasas, fosfolipasas, activa todo lo que encuentre en la célula. Entonces ¿dónde está el calcio?: El mayor reservorio de calcio en la célula son las cisternas del RE (Ca2+ que se puede movilizar, porque el mayor reservorio de Ca2+ en sí es la mitocondria). El Ca2+  se puede movilizar del RE al citosol y viceversa. Ante determinados estímulos como el AMPc, aumenta la concentración de calcio en el citosol. Este Ca2+ en general, está unido a proteínas que tienen un motivo “mano EF” (combinaciones de estructuras secundarias) que es característica en proteínas que unen calcio. Hay una proteína que es unidora por excelencia: la calmodulina.


La calmodulina tiene la capacidad de unir cuatro Ca2+ (tiene cuatro motivos “mano EF”). Cuando la calmodulina une los cuatro Ca2+ cambia la conformación. Es un cambio conformacional inducido por Ca2+: regulación no covalente de tipo alostérica. La calmodulina, una vez que cambia la conformación, va a tener la capacidad de unirse a otro péptido, en general son las CaM Kinasas (cinasas moduladas por calmodulina). La enzima para ser activa debe unirse a la calmodulina unida al Ca2+.

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